低速离心机提取的血红蛋白与分离实验步骤-上海赵迪生物科技有限公司
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低速离心机提取的血红蛋白与分离实验步骤

2017/10/12 10:32:13      点击:

 1、实验原理
蛋白质的物化理性质:形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别,由此提取和分离各种蛋白质。

(1)凝胶色谱法(分配色谱法):

①原理:分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部,路程长,流动慢。
②凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。


③分离过程:
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。
④作用: 分离蛋白质,测定生物大分子分子量,蛋白质的脱盐等。

(2)缓冲溶液

①原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3—NaHCO3, NaH2PO4/Na2HPO4等),调节酸和盐的用量,可配制不同pH的缓冲液。
②缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

(3)凝胶电泳法:

①原理:不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同,在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同,导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
②分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
③分离过程:在一定pH下,使蛋白质基团带上正电或负电;加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质—SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。


2、实验步骤


(1)样品处理
① 红细胞的洗涤
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白,采集的血样要及时采用低速离心机短时间离心分离红细胞,然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆,将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯,再加入五倍体积的生理盐水,缓慢搅拌10min,低速短时间离心,如此重复洗涤三次,直至上清液中没有黄色,表明红细胞已洗涤干净。
②血红蛋白的释放 
在蒸馏水和甲苯作用下,红细胞破裂释放出血红蛋白。
注:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜,有利于血红蛋白的释放和分离。

(2)粗分离
①分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液离心后,试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,是脂溶性物质的沉淀层,第3层是红色透明液体,这是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤,除去之溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。
②透析
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中,透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质,或用于更换样品的缓冲液。
(3)纯化:调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
(4)纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳