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低速冷冻离心机制备及转化大肠杆菌感受态细胞的实验步骤

2017/2/18 15:05:25      点击:
[实验目的]
通过本实验,掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术
 
[实验原理]
 
细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
 
[实验仪器与设备]
 
1.超净工作台 2.低速冷冻离心机
 
3. 恒温摇床 4. 恒温箱
 
5. -70℃ 6. 恒温水浴器
 
[实验材料]
 
1.氯化钙(CaCl2) 2.胰蛋白胨
 
3.酵母提取物 4.氯化钠(NaCl)
 
5.氨苄青霉素 6.大肠杆菌DH5α
 
7.pUC19质粒 8. 50ml离心管
 
9.吸头、培养皿、锥形瓶等
 
附试剂的配制:
 
1. 0.1mol/L CaCl2溶液
 
2. LB液体培养基
 
配制每升培养基,应在950ml去离子水中加入:
 
胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g
 
酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g
 
NaCl 10g
 
摇动容器直至溶质完全溶解,用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。
 
3.氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成100mg/ml溶液,置-20℃冰箱保存。
 
[实验步骤]
 
1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2ml LB液体培养基的试管中,37℃振荡培养过夜。
 
2.取0.5 ml菌液转接到一个含有50ml LB液体培养基锥形瓶中, 37℃振荡培养2-3h.(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ ml,此为实验成功的关键).
 
3.将菌液转移到50 ml离心管中,冰上放置10min.
 
4.离心10min(4000rpm),回收细胞.
 
5.倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽.
 
6.用冰冷的0.1mol/L CaCl210ml悬浮沉淀,立即放在冰上保温30min。
 
7.0-4℃6000rpm,离心10min,回收细胞。
 
8.用冰冷的0.1mol/L CaCl22ml悬浮细胞 。(务心放冰上)
 
9.分装细胞,每200μl一份。此细胞为感受态细胞。
 
10.取200μl新鲜配制的感受态细胞,加入DNA 2μl(50ng)混匀,冰上放置30min。
 
同时做两个对照管:
 
受体菌对照:200μl感受态细胞+2μl无菌水
 
质粒对照:200μl 0.1mol/L CaCl2溶液+2μl质粒DNA溶液
 
11.将管放到42℃循环水浴1-2min。
 
12.冰浴2min.
 
13.每管加800μl LB液体培养基,37℃培养1h(慢摇)。
 
14.将适当体积已转化的感受态细胞,涂在含有氨苄青霉素的固体培养基上。
 
15.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。
 
[作业]
 
观察在含氨苄青霉素的琼脂糖平板上生长的菌落生长情况,并分析原因
 
[实验安排]
 
15学时
 
第1天下午—第2天上午:配LB培养基,接种,液体培养
 
第2天上午、下午:继续培养2-3h,制备感受态细胞,转化,培养12-16h
 
第3天上午:观察结果