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台式低速离心机分离叶肉细胞的方法

2015/8/28 10:25:06      点击:

一、离心机分离法

分离叶肉细胞 [仪器与用具] 组织捣碎机一台(或研钵一套); 低速台式离心机1台; 100目尼龙纱布30cm×30cm 1块; 100ml量筒1个; 100ml烧杯2个; 200ml烧杯1个; 冰瓶1个; 离心管、吸管若干。

[试 剂] STN液(蔗糖0.4mol·L-1,Tricine 20mmol·L-1 pH 7.8, NaCl 10mmol·L-1)。将137g 蔗糖、3.58g Tricine(三羟甲基甘氨酸)、0.58g NaCl溶于800ml左右水中,用NaOH溶液调至pH 7.8,加水至1000ml。STN液置0-4℃冰箱中备用。

[方 法]
 1.选用山芋、大豆等植物的嫩叶50g左右,洗净,去叶脉,剪成2mm左右宽的叶条,放入捣碎机中,加入150ml左右的冷STN液,以10000转/分,快速捣碎15秒,或将10g左右叶片剪碎,放入研钵中,加入50ml冷STN液,研磨1分钟。

 2.先将匀浆用100目的单层尼龙纱布过滤,将滤液用台式离心机低速(500转/min)离心30秒。去上层液,用少量STN液悬浮沉淀,悬浮液即为叶肉细胞。如果第一次离心后,沉淀中细胞碎片较多,可再悬浮离心一次。提取过程最好在4℃左右温度下进行。

 3. 细胞悬浮液放冰瓶中备用。

 二、酶解法

分离叶肉细胞 [仪器与用具] 抽真空装置1套或大针筒1套; 恒温水浴(最好用恒温振荡器)1台; 感量0.01g天平1台; 离心机1台; 100和50ml烧杯各2个; 镊子1把; 剪刀1把; 100目尼龙纱布30cm×30cm 1块; 刀片一把; 载玻片一块。

 [试 剂] 分离介质:糖醇0.4mol·L-1 (称7.3g山梨醇或甘露醇定溶于100ml水中),,离析酶(Macerozyme R-10)3%,葡聚糖硫酸钾0.4%与聚乙烯吡咯烷酮2%,pH5.6~5.8,称0.3g离析酶、0.04g葡聚糖硫酸钾、0.2g聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml 0.4mol·L-1山梨甘露醇溶液中,滴加HCl调至pH 5.6~5.8。 悬浮介质:STN液(配法同上)。

 [方 法]
 1. 取蚕豆等嫩叶2g左右,用镊子撕去下表皮。不能撕表皮的可用剪刀剪,或用刀片切成2mm宽碎条。放烧杯中,加20ml分离介质,用抽真空装置或针筒真空渗入15秒,使分离介质渗入叶内。

 2. 将酶解体系放入25~30℃水浴中,每隔2-3分钟振动一次,酶解30分钟左右,直至肉眼可见溶液中有较多的叶肉细胞沉淀为止。

 3. 用100目尼龙纱布过滤酶解介质,将滤液500转/min离心30秒,舍去上层液,用10ml STN液悬浮沉淀,再离心一次,去上层液,沉淀中加入2mlSTN液稀释,即得到叶肉细胞悬浮液,细胞悬浮液置冰瓶中备用。

 三、细胞活力的检查

 [仪器与用具] 显微镜1台;氧电极测定光合放氧装置(见实验23)1套;吸管3支;5mL、1mL移液管各2支;0.1mL微量进样器;载玻片与盖玻片若干等。

 [试 剂] 0.1%酚藏红花染液; 光合放氧测定介质(Tricine 50mmol L-1 pH7.6,NaHCO3 20mmol L-1,蔗糖0.4mol L-1) 称0.9gTricine、10.3g蔗糖、0.17gNaHCO3溶于80mL水中,用稀NaOH调至pH7.6,加水至100mL。

 [方 法]
 1、 检细胞形态: 叶片中叶肉细胞的大部分是栅栏细胞和海绵细胞,多数呈花生形。活的叶肉细胞中的叶绿体排列规则,分布均匀,在高倍镜下能看到细胞器在原生质体中移动。而受伤和死细胞,细胞收缩,叶绿体排列混乱,甚至解体,细胞内颗粒作无规则的布朗运动。

 2、 色检查: 将0.1%酚藏红花染液同细胞悬浮液混合,几分钟后镜检。死细胞被染上红色,而活细胞不被染色。

 3、合放氧活性测定: 在氧电极反应杯中加5份光合放氧测定介质,1份细胞悬浮液,照光,观察是否有放氧反应。

 注意事项

 1. 不是所有植物的叶片都能用机械法分离出完整的叶肉细胞的,机械法仅适用于山芋、大豆、花生、苹果、槐树等植物叶片。分离细胞的活性还与叶龄有关,如分离具有高活性的大豆叶肉细胞,应采集倒2、倒3的嫩叶作为材料。

 2. 离体的叶肉细胞的活性随离体时间延长而降低。