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台式低速离心机如何从植物盐藻中分离叶绿体

2016/3/24 9:15:26      点击:

取培养7d 的藻细胞培养液利用台式低速离心机采用离心力4500g 离心10min,细胞沉淀重悬在新鲜的生长培养

基中充分洗涤,然后4500g 离心10min,除去一些细胞外的粘稠物.

将离心得到的细胞沉淀重悬在冰预冷的15mL 分离缓冲液( 1mol/ L Sorbitol,50mmol/ L Hepes,2mmol/ L EDTA,1mmol/ L MnCl2,1mmol/ LMgCl2,0.5% BSA,0.1 mol/ L DTT,用KOH 调节到pH 7.5) 中.

将15mL 重悬细胞液进行冰浴超声波破碎,超声波功率200W,共作用64s,每次作用时间8s,间隔时间9.9s.然后4℃2000g 离心10min,沉淀重悬在3mL 的分离缓冲液中,作为叶绿体粗提液.

将叶绿体粗提液加在蔗糖密度梯度( 30%/ 45%/ 59% ,30mL) 上,4℃40000g 离心30min,吸取45%和59% 之间的条带( 约5mL) ,用3 倍体积的清洗缓冲液( 1 mol/ L Sorbitol,25mmol/ L Hepes,用KOH 调节到pH 7.5) 清洗收集物,4℃2000g 离心10min,沉淀即为完整的叶绿体.