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奶及奶制品中黄曲霉素M1的乳脂离心机检测

2016/6/12 23:09:09      点击:

   黄曲霉毒素主要存在于谷物、坚果、花生、棉籽粉、玉米、干辣椒粉等食品中以及一些与人类血液,动物饲料相关的产品中。霉菌的生长并不一定表明黄曲毒素的存在,因为黄曲毒素只有在湿度、温度适合及通风良好才会生成。黄曲霉素B类具有蓝色荧光,G类具有绿色荧光。除了蔬菜中常见的(B1,B2,G1,G2),还有存在喂食了有毒饲料的奶牛的牛奶中的黄曲霉素M,其中毒性最高的M的代谢物为4-羟基化的产物Bs.黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物,也是一种强致癌物质。其危害巨大,人类日常消费食品中如牛乳及其制品是易受到黄曲霉毒素M1污染的食品之一。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用,严重时,可导致肝癌甚至死亡。毒性是砒霜的100倍其实主要是指黄曲霉毒素比砒霜毒。
 
 目前来讲,Aflatoxin M1的检测方法有高效液相色谱法(HPLC),酶联免疫检测法等。液相色谱法可以精确的检测奶制品中黄曲霉毒素的微小含量。而使用黄曲霉毒素M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素M1残留。

高效液相色谱法:根据国标《GB 5413.37—2010》食品安全国家标准乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定 

实验用前处理:实验仪器和好耗材包括:恒温水浴锅  溶剂过滤器(带真空泵)1000ml  高速匀质器 黄曲霉毒素免疫M1亲和柱玻璃纤维滤纸 玻璃注射器 无荧光特性玻璃试管 空气压力泵 超声波清洗机  定量滤纸 量筒 样品瓶 容量瓶 移液器或移液管

实验用试剂:色谱乙腈 色谱甲醇 氢氧化钠 石油醚 超纯水或去离子水等等

HPLC条件: 高效液相色谱仪   色谱柱 C18柱,150*4.6mm,5um 流动相 乙腈-水(25:75) 荧光检测器: 激发波长365nm,发射波长435nm; 柱  温 室温 流速 1.0ml/min 进样量 20ul 出峰时间 10分钟左右  

样品取样:真菌毒素分析的最大误差来源是样品的收集和取样过程,所以必需保证样品收集和取样具有代表性。

样品前处理:不同样品
 牛奶  水浴加热至40度,离心用上清液过柱净化;
 乳粉和粉状婴幼儿配方食品:称取适量奶粉样品,用于蒸馏水中,混合均匀使其充分溶解,离心离心用上清液过柱净化;
 发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型):称取适量奶粉样品,用于蒸馏水中,调节PH值至微碱性,高速均质器匀浆,水浴加热后离心,取上清液混合均匀使其充分溶解,离心离心用上清液过柱净化;
 干酪:称取适量切细或粉碎,过筛用加纯水溶解,高速均质器匀浆,超声提取后收集上清液,然后用石油醚进行两次萃取,然后用适宜的有机溶液萃取,取若干上清液过柱净化
 奶粉样品,用于蒸馏水溶解中,调节PH值至微碱性,水浴加热后离心,取上清液混合均匀使其充分溶解,离心离心用上清液过柱净化;
 奶油:称取适量加甲醇水溶解,震荡后分液漏斗取下层溶液,蒸干后溶于水用于过柱净化。
 
免疫柱净化步骤:完全符合GB/T 18980-2003
1、取出免疫亲和层析柱, 恢复至室温,将上方塞子取出斜剪断,再插回亲和柱上。
2、将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下。准确移取清澈液注入玻璃注射器;
3、将空气压力泵与玻璃注射器连接,调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2~3mL空气通过柱体;
4、更换玻璃注射器与亲和柱连接,在注射器中加入10ml水,调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。
5、准确加入4mL色谱级乙腈洗脱,流速为1 mL/min ~2mL/min,收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测。

注:收集管中的洗脱液即为纯化后的样品,可直接用ELISA,荧光和高效液相等方法检测。 HPLC 检测需要仪器与耗材 产品名称 说明 黄曲霉毒素M1固体标准品 参比对照使用 黄曲霉毒素M1液体标准品 浓度0.5ug/ml, 溶于乙腈 PriboFast 黄曲霉素M1免疫亲和柱 用于 样品前处理柱 分析黄曲霉素 PriboFast泵流操作架(8位) 用于免疫亲和柱净化样品处理,方便控制流速 黄曲霉毒素检测专用玻璃纤维滤纸 用于去除HPLC检测时部分杂峰,有效提高灵敏度。110,1.5um 不锈钢均质器  高速匀浆样品,有效提高萃取效率 旋转蒸发仪-超声波发生器等配套设备

     酶联免疫检测法:符合国家标准酶联免疫检测法采用竞争ELISA,在微孔板上预包被黄曲霉毒素B1抗原,加入样本(或黄曲霉毒素M1标准品溶液)及辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。样本或标准品溶液中的黄曲霉毒素M1与预包被在板孔上的黄曲霉毒素M1抗原竞争结合辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素M1抗体。未结合的酶标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液,读取吸光值。样本的吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素M1抗原的含量成负相关。对照标准曲线,即可得出相应残留物黄曲霉毒素M1的含量。

样品处理牛奶 直接离心取上清液用于检测奶粉及其他固状奶制品:需要溶解于去离子水中,乳脂离心机离心取上清液用于检测试剂盒检测时间:30分钟+30分钟交叉反应率: Aflatoxin M1 100% Aflatoxin B1 8% Aflatoxin B2 10% Aflatoxin G1 7% Aflatoxin G2 5% ELISA 方法检测需要:   说明 PriboFast 黄曲霉毒素M1酶联免疫检测试剂盒 96T 检测范围 (0.1 ppb -8.1ppb) 移液器(彩色) 多个量程:0.5-10; 20-200; 5-50; 1000-5000ul 八道半支灭菌移液器 量程: 5-50ul; 50-300ul 酶标仪等 进口、国产仪器, PriboFast试剂盒采用直接竞争法,检测时间短,步骤简单,性能稳定,检测限符合国标要求。

对分析人员要求:化学分析仪器及其相关专业或有高效液相色谱仪操作经验的人员均可很快掌握黄曲霉毒素M1检测技术。