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台式微量高速离心机快速提取质粒DNA与鉴定

2016/3/16 13:30:14      点击:
[实验原理]
基因工程诞生于1973年.在这一年.斯坦福大学的S.Cohen等人将大肠杆菌的抗四环素质粒PSC101和抗新霉素及磺胺的质粒R6-3在体外用EcoRI进行切割,并把他们连接在一起形成一新的重组质粒:然后,将此重组质粒转化到大肠杆菌中.结果,在含有四环素和新霉素和新霉素的平皿中,筛选出了抗四环素和新霉素的重组菌落.这是第一次实现重组体转化成功的例子,基因工程从此诞生.目前,基因工程已成为分子生物学的一个重要领域,但对其还没有一个统一的公认定义.一般认为基因工程是指:在体外,将核酸分之(无论采取什么方法从细胞中取得)组合到任何病毒、细菌质粒或其它载体系统(分子)中,形成遗传物质的新组合,并使之进入原来没有这类分子的宿主体内,而能持续稳定地繁殖.基因工程的最大特点使以重组DNA技术开辟了在短时间内改造生物遗传性状的新天地.
基因工程的研究内容如下:
1. 目的基因的获取 .
2. 克隆载体的选择与改建.
3. 目的基因与载体的连接.
4. 重组DNA导入受体细胞.
5. 重组体的筛选.
6. 设法使目的基因实现功能蛋白的表达.
基因工程的重要环节就是如何把外源基因导入到受体细胞中去.外源基因自己很难进入受体细胞中,既是进入受体细胞中,一般也不能进入复制和表达.这是因为我们得到的目的基因不带有复制子系统和表达调空系统,所以我们必须利用运载工具即载体将外源基因导入到受体细胞中去.
质粒就是一种最常用的载体.他是染色体以外的能自主复制的双莲、闭合、环状DNA分子.广泛存在于细胞中,在一些动、植物细胞中也发现有质粒存在.作为载体的质粒必须具备以下六个特点:(1)能自主复制:(2)具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点,并在位点中插入外源基因后,不影响其复制功能:(3)具有1-2个筛选标记:(4)分子量小,多拷贝,易于操作:(5)是非结合性质粒即不含有结合转移基因,在自然条件下不能从一个细胞转移到另一个细胞中去:(6)转化效率高.
本次实验是从大肠杆菌中提取和纯化质粒,以备进一步研究之用,其原来如下:
从大肠杆菌中提取和纯化质粒的方法很多,但不外乎三个主要步骤即细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒的分离和纯化.
1. 细菌的培养
挑单个菌落接种到适当培养基中培养.通常以细菌培养夜的O.D600nm值来判断细菌的生长状况,一般情况下,O.D600nm=0.4时,细菌处于对数生长期:O.D600nm=0.6时细菌处于对数生长后期.由于质粒在细菌内进行复制时,往往受到宿主的控制,因此在对数生长后期可进入氯霉素.氯霉素可抑制细菌的蛋白质生物合成和染色体DNA的复制,而质粒的复制不受其影响而得以大量扩增.对于新一代的质粒如pUC质粒系列,由于宿主对其复制控制不严,所以添加氯霉素已不十分必要.使用氯霉素的目的是,在不减低质粒产量的前提下,减少细菌的培养体积和数量以降低细菌裂解物的复杂性和粘稠度.
2. 细菌的收集和裂解
细菌在生长过程中,会将大量代谢物排到培养液中.为提高质粒的纯度,往往通过离心弃除培养液,在将细菌沉淀适当干燥或用缓冲液漂洗1~2次,以便尽量将培养液去除干净.
裂解细菌的方法很多,如SDS法、裂解法、煮沸法等.它们各有利弊,应根据所提质粒的性质、宿主菌的特性及纯化质粒的方法等因素加以选择.
本实验采用碱裂解法.首先破坏细菌的细胞壁:再用SDS使细胞膜崩解,与此同时用NaOH提高溶液的pH值,使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性.
3. 质粒的分离和纯化
往第二步溶液中加入酸性溶液使裂解液的pH值恢复到中性,此时,质粒可复性并恢复原型,而染色体DNA仍处于变性状态.经离心,染色体DNA与细胞碎片一起沉淀.然后,再用酚、氯仿等蛋白质变性剂去除蛋白质,用Rnase去除RNA,即可得到质粒的粗制品.以后,可用超离心法、电泳法、离子交换层析法或排组层析法等进一步纯化质粒.
[仪器与消耗]
1.仪器:YXQ-SG41-280型电热手提高压锅、HZ-C恒温空气震荡器、TG-13W微量高速离心机、WH-861型旋涡混匀器、SIN-F123颗粒型制冰机、SC-326冰箱、可调式移液器.
2.耗材:含有重组质粒(pUC18/GAPDH)的菌株(HB101)Eppendorf管、吸
[步骤]
1.酶切:20μl酶切体系(按下表加试剂)
 质粒DNA 10╳酶缓冲液 EcoRI(15u/μL) BamHI(15u/μl) 双蒸水
实验组1 6μL 2μL 1μL 1μL 10μL
实验组2 6μL 2μL 1μL 11μL
对照组 6μL 2μL — -- 12μL
混匀,37℃水浴1-2小时.
2.向上述个反应管中,分别加入4μL 6×上样缓冲液.
3.电泳:
① 将1%浓度的琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)铺于水平电泳槽上,并插上梳子.
② 待凝胶凝固,将梳子拔出.往电泳槽中注入0.5×TEB缓冲液,直至刚没过凝胶.
③ 按以下顺序上样:
1道 2道 3道 4道
DNA分子量标准(Marker) 对照组样品(未酶切质粒) 实验组1样品 实验组2样品
④将加样一端接上负极,另一端接上正极,电场强度5V/cm,待溴酚蓝移动到接近正极一端停止电泳.
⑤将凝胶移至黑暗处,用紫外灯观察电泳结果.
[试剂]
1. EcoRI(15u/μL)
2. BamH I(15u/μL)
3. 5×TBE(pH8.3电泳缓冲液)Tris 5.4g
硼酸 2.25g
EDTA 0.46g
ddH2O2定容至 100ml
4. 1%琼脂糖:琼脂糖1g,0.5×TBE100ml.
5. 6×上样缓冲液:50%甘油,1×TBE,0.5%溴酚蓝 ,0.5%二甲苯青
6. 溴化乙锭(EB):0.5mg/ml
质粒DNA