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台式高速冷冻离心机分离细菌外膜蛋白的方法

2015/9/15 20:29:02      点击:


① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌,37℃,200rpm。

② 台式高速冷冻离心机10000g、20min、4℃离心,去上清。

③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬,同样条件离心,再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。

④ 超声波破碎细菌。

⑤ 3000g,10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清(含有胞质成分和细菌外被成分)。

⑥ 超速离心I:100,000g,60min,4℃,去除上清(胞质成分),收集细菌外被成分。

⑦ 用10ml含2%的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物,室温温育20-30min。

⑧ 超速离心II:70,000g,60min,室温沉淀收集外膜蛋白,去除上清(含细胞质膜)。重复⑦、⑧两步。

⑨ 充分吸除上清,并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式:蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度,调节蛋白浓度至40ug/ul,该蛋白质样品-70℃贮存。


试剂

① Tris-Mg 缓冲液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3,4℃保存

② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)