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禽流感红细胞凝集抑制实验详细步骤

2017/2/14 22:37:42      点击:

:实验前准备

1. 抗原:根据指定免疫类型从生物公司购买稳定的浓缩抗原

2. 抗凝剂的配制:用分析天平称取3.8克柠檬酸三钠,溶解于100毫升生理盐水中,待溶解完全后即可使用。

3. 1%红细胞悬液制作:去菜市场找杀鸡的,去找他们用试管接新鲜鸡血,试管中提前加入抗凝剂,加入的抗凝剂与你所接血液的比例大概为1:2,并迅速混匀,在离心机中以3000转离心五分钟,用吸管吸取上清液和红细胞上层的白细胞薄膜,将沉淀的红细胞加生理盐水,慢慢混合均匀,不要弄碎了红细胞,再在离心机中3000转离心五分钟,弃去上清,再加生理盐水混匀,如此往复四到五次。最后一次离心后,去掉上清,管低即为红细胞泥,用吸管吸取0.1毫升红细胞泥,然后加入9.9毫升的生理盐水就是1%的红细胞悬液,现用现配不要长时间存放。

4. 被检血清:乡镇送来的血液,离心取上清即为被检验血清,注意做标记,一管一标记,别弄混了。

5. 血清稀释液:为灭菌生理盐水,即高压过的生理盐水


二:实验步骤

血凝(HA)实验目的是测定抗原效价,即为了制作后面的四单位抗原

1.首先用微量移液器向96孔V型板的每一孔加生理盐水25微升

2.用微量移液器吸取待测抗原(就是你买的抗原)的25微升于第一孔中并且挤压六次混合,后吸出25微升至第二孔,依次倍比稀释到第11孔,11孔中弃去25微升。这一过程最好一孔一换针头。

3.用微量移液器再吸取1%红细胞悬液一次加入各孔,每孔25微升

4.置于微量振荡器上震荡一分钟

5.室温静置30分钟观察结果

6. 结果观察:

将反应板倾斜成45度角,沉于底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞被或者不完全被病毒所凝集:
如果孔底的红细胞铺平孔底,凝集成均匀薄层,说明被病毒凝集。
能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释浓度,成为该抗原滴度红细胞凝集效价,即这个比例稀释的抗原就是一单位的抗原。比如第八孔红细胞完全凝集,但第九孔红细胞不凝集,那么这个抗原的效价为1:256。
也就是你买来的抗原稀释256倍为一单位抗原,那么稀释64倍就是四单位抗原。

四单位抗原校正:

1. 就是你依照上个实验所作出的抗原效价来配置,比如假设上一步抗原效价为1:256,那么四单位抗原就是256除以4为64倍稀释浓度的抗原,也就是你将买来的抗原稀释64倍就是四单位的抗原,但是你买的抗原不同,鸡红细胞的本身原因,计算出的抗原效价不同,所以你必须先做抗原效价的计算。
2. 首先用微量移液器向反应板的第二孔至第六孔加生理盐水25微升,第一孔不加。
3. 用微量移液器吸取四单位抗原25微升分别加入第一孔,第二孔,从第二孔开始挤压六次混匀,后从第二孔吸出25微升至第3孔,依次倍比稀释到第五孔,弃去25微升。
4. 用微量移液器再吸取1%红细胞悬液依次加入1到6孔,每孔25微升。
5. 在微量振荡器上震荡一分钟。
6. 室温静置30分钟观察结果
7. 如果照上面的结果来计算,如果第四孔发生百分之五十红细胞沉淀而第五孔完全凝集,那么久说明四单位抗原制作准确。

血凝抑制实验(HI):每排只能查一份血清,步骤如下
1. 用微量移液器先加25微升生理盐水在每个孔中
2. 用微量移液器吸取待检测血清25微升于第一孔中,然后倍比稀释至第11孔,(就是稀释原则跟上面的一样),最后11孔弃去25微升,最后第12孔不加血清,作为对照试验。